Desarrollo de la embriogénesis somática y su empleo en la transformación genética por biobalística en el cultivar híbrido de plátano ‘FHIA-21’ (Musa sp. AAAB)

Abstract

La transformación genética es una metodología para obtener nuevos clones en un período de tiempo relativamente corto, sin embargo, su éxito depende en gran medida de la disponibilidad de un sistema eficiente para la regeneración de plantas y de la efectividad de las construcciones genéticas. El primer objetivo general del presente trabajo fue desarrollar un esquema para la embriogénesis somática en el cultivar híbrido de plátano ‘FHIA-21’ (Musa sp. AAAB). Se empleó este esquema para desarrollar el segundo objetivo general: la transformación genética mediante una pistola de genes de baja presión con el gas argón en el mismo cultivar híbrido de plátano. Los resultados demostraron que fue posible establecer suspensiones celulares embriogénicas a partir de embriones somáticos obtenidos de callos formados de flores masculinas inmaduras. A una densidad celular de 20% de volumen de células sedimentadas y con el medio de cultivo M3a, se formó el mayor número de embriones somáticos a partir de las suspensiones celulares. Otros resultados alcanzados en este trabajo revelaron que los embriones somáticos necesitaban ser transferidos a un medio de cultivo para su maduración durante un período de 20 días para mejorar los porcentajes de germinación. No obstante, los embriones somáticos formados al 15% de volumen de células sedimentadas y con 20 a 30 días en el medio de maduración lograron los mejores resultados en cuanto a la germinación. Para lograr la expresión transitoria del gen uidA, se ajustaron algunos parámetros que influyen en la transformación genética por biobalística. La mejor combinación de presión y distancia de bombardeo fue de 140 psi y 12 cm respectivamente, así con el recubrimiento de las micropartículas propuesto por Sanford et al. (1993). Los plásmidos conducidos por el promotor poliubiquitina del maíz lograron mayores niveles de expresión del gen uidA. El aumento de la cantidad de micropartículas no influyó en los resultados, pero al realizar dos disparos sobre el mismo blanco biológico se produjo una caída significativa en la expresión transitoria del uidA. En cuanto al parámetro biológico, los mejores resultados se alcanzaron cuando se utilizaron células embriogénicas recolectadas a los 5 días y a los 10 días después del último subcultivo. La mínima concentración inhibitoria del herbicida BASTA sobre los agregados celulares fue de 6.0 mg.L-1. Genetic transformation is a methodology to obtain new clones in a relatively short period of time, however, its success depends to a large extent on the availability of an efficient system for the regeneration of plants and the effectiveness of genetic constructions. The first general objective of the present work was to develop a scheme for somatic embryogenesis in the plantain hybrid cultivar 'FHIA-21' (Musa sp. AAAB). This scheme was used to develop the second general objective: the genetic transformation by means of a low pressure gene gun with the argon gas in the same plantain hybrid cultivar. The results showed that it was possible to establish embryogenic cell suspensions from somatic embryos obtained from calluses formed from immature male flowers. At a cell density of 20% volume of settled cells and with the culture medium M3a, the largest number of somatic embryos was formed from the cell suspensions. Other results reached in this work revealed that somatic embryos needed to be transferred to a culture medium for maturation during a period of 20 days to improve germination percentages. However, somatic embryos formed at 15% volume of sedimented cells and with 20 to 30 days in the maturation medium achieved the best results in terms of germination. To achieve transient expression of the uidA gene, some parameters that influence genetic transformation by biobalistic were adjusted. The best combination of pressure and distance of bombardment was 140 psi and 12 cm respectively, thus with the coating of the microparticles proposed by Sanford et al. (1993). The plasmids driven by the corn polyubiquitin promoter achieved higher levels of expression of the uidA gene. The increase in the amount of microparticles did not influence the results, but when carrying out two shots on the same biological target, there was a significant fall in the transient expression of uidA. Regarding the biological parameter, the best results were achieved when embryogenic cells harvested at 5 days and 10 days after the last subculture were used. The minimum inhibitory concentration of the herbicide BASTA on the cellular aggregates was 6.0 mg.L-1.(traducción automática)