Alternativas para la obtención de proteasas a partir de Hohenbergia penduliflora (A. Rich.) Mez.

Abstract

Las plantas de la familia Bromeliaceae son una fuente natural rica en cisteino proteasas, las cuales se utilizan en la industria alimenticia, biotecnológica y farmacéutica. Esto hace que se incremente el interés por estudiar nuevas fuentes para la obtención de fitoproteasas. Hohenbergia penduliflora (A. Rich.) Mez. es una planta que pertenece a esta familia y hasta la fecha no se conocen sus potencialidades en ese sentido. El lento crecimiento de esta planta unido a la ocurrencia de una sola floración por año limitan la disponibilidad de material vegetal en su hábitat natural. La presente investigación se realizó con los objetivos de: Aislar, purificar y caracterizar proteasas a partir de plantas de H. penduliflora crecidas en su hábitat natural; Establecer una metodología de propagación in vitro de H. penduliflora para incrementar la disponibilidad de material vegetal a usar como fuente de extracciones de proteasas y Determinar el efecto del ácido 2-cloroetilfosfónico (ethrel) en la induccción de proteasas y en indicadores bioquímicos y fisiológicos en plantas de H. penduliflora aclimatizadas. Inicialmente, se colectaron plantas adultas en el Área Protegida Loma de Cunagua y se obtuvieron extractos protelíticos crudos de hojas, tallos y frutos. Se identificó la presencia de cisteino proteasas activas y estables en tallos, con masas molares entre 21 000 y 30 000 Da y punto isoeléctrico a pH ácido. Además, se aisló, purificó y caracterizó parcialmente una nueva proteasa: la pendulifloraina I, con masa molar de 23 412 Da. Esta enzima mostró elevada homología con cisteino proteasas de la familia C1 aisladas de plantas de la familia Bromeliaceae. Por otra parte, se estableció una metodología para la propagación in vitro de esta planta, la desinfección de las semillas se logró con hipoclorito de sodio (2%, v:v) durante 20 minutos. La mayor multiplicación de los brotes se obtuvo en medio líquido de Murashige y Skoog suplementado con 8,8 μmol·L-1 de 6-benciladenina y 1,61 μmol·L-1 de ácido naftalenacético. El corte desde la región apical hasta la base del brote favoreció la multiplicación. El tiempo de cultivo adecuado para la multiplicación fue de 45 días hasta 6 subcultivos. El enraizamiento in vitro fue mejor en el medio de Murashige y Skoog suplementado con 3,22 μmol·L-1 de ácido naftalenacético. Con la utilización del sustrato cachaza se logró el mayor índice de supervivencia en la aclimatización de los brotes. Se comprobó que la actividad proteolítica específica en extractos de tallos de plantas aclimatizadas tratadas con ethrel (4,5 mg·L-1) fue 2,5 veces superior a los obtenidos en los tallos de plantas provenientes del hábitat natural. El ethrel provocó cambios en indicadores bioquímicos y fisiológicos asociados a la senescencia en hojas de plantas aclimatizadas. The plants of the family Bromeliaceae are a natural source rich in cysteine proteases, which are used in the food industry, biotechnology and pharmaceutical. This increases the interest in studying new sources for obtaining phytoproteases. Hohenbergia penduliflora (A. Rich.) Mez. It is a plant that belongs to this family and to date its potentialities are not known in that sense. The slow growth of this plant together with the occurrence of a single flowering per year limit the availability of plant material in its natural habitat. The present investigation was carried out with the objectives of: Isolate, purify and characterize proteases from H. penduliflora plants grown in their natural habitat; Establish an in vitro propagation methodology of H. penduliflora to increase the availability of plant material to be used as a source of protease extractions and determine the effect of 2-chloroethylphosphonic acid (ethrel) on the induction of proteases and on biochemical and physiological indicators in plants of H. penduliflora acclimatized. Initially, adult plants were collected in the Loma de Cunagua Protected Area and crude protelitic extracts of leaves, stems and fruits were obtained. The presence of active and stable cysteine proteases was identified in stems, with molar masses between 21,000 and 30,000 Da and isoelectric point at acidic pH. In addition, a new protease was isolated, purified and partially characterized: pendulifloraine I, with a molar mass of 23 412 Da. This enzyme showed high homology with cysteine proteases of the C1 family isolated from plants of the Bromeliaceae family. On the other hand, a methodology was established for the in vitro propagation of this plant, disinfection of the seeds was achieved with sodium hypochlorite (2%, v: v) for 20 minutes. The greatest multiplication of shoots was obtained in liquid medium of Murashige and Skoog supplemented with 8.8 μmol·L-1 of 6-benzyladenine and 1.61 μmol·L-1 of naphthalene acetic acid. The cut from the apical region to the base of the shoot favored multiplication. The appropriate culture time for multiplication was 45 days to 6 subcultures. The in vitro rooting was better in the Murashige and Skoog medium supplemented with 3.22 μmol·L-1 of naphthaleneacetic acid. With the use of the cachaza substrate, the highest survival rate in the acclimatization of the outbreaks was achieved. It was found that the specific proteolytic activity in extracts of stems of acclimatized plants treated with ethrel (4.5 mg · L-1) was 2.5 times higher than those obtained in the stems of plants from the natural habitat. The ethrel caused changes in biochemical and physiological indicators associated with senescence in leaves of acclimatized plants.(traducción automática)