Sistemas de inmersión temporal, elicitación y transformación genética en Digitalis purpurea L.

Abstract

Digitalis purpurea L. es una de las dos únicas especies de interés económico del género Digitalis. Su importancia radica en que constituye una de las principales fuentes de cardenólidos, fármacos irreemplazables en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. El presente trabajo se realizó con el objetivo de estudiar diferentes estrategias biotecnológicas en Digitalis purpurea L. que permitirán disponer de la base metodológica para el desarrollo de una tecnología para la producción in vitro de cardenólidos. Para su cumplimiento se desarrolló un método de producción de biomasa en sistemas de inmersión temporal (SIT), se determinó el efecto de elicitores en el contenido de cardenólidos y se desarrolló un protocolo para la transformación genética mediado por Agrobacterium tumefaciens. La mayor producción de biomasa por SIT (104,03 gMF y 5,74 gMS) se obtuvo cuando se inocularon 12 explantes. La frecuencia de inmersión influyó en la producción de biomasa y de cardenólidos en los brotes. En el tratamiento con inmersiones cada 4 horas se obtuvo la mayor producción de biomasa y producción neta de cardenólidos por SIT (digitoxina 167,6 μg y digoxina 119,9 μg). La renovación adicional de la atmósfera interna en los SIT, como otro factor evaluado, indujo un mayor estrés oxidativo asociado a un aumento de la síntesis de digitoxina. Estos resultados permitieron realizar el escalado en SIT de 5L de capacidad y diseñar un esquema de producción como estrategia para la obtención de cardenólidos in vitro. Por otra parte, se demostró que la elicitación es una estrategia posible para el incremento de cardenólidos en brotes de D. purpurea. El SilioPlant® (0,01 g.L-1) incrementó la síntesis de cardenólidos en los brotes multiplicados in vitro en 3,6 y 6,9 veces el contenido de digoxina y digitoxina respectivamente, en comparación con el control. Se desarrolló un protocolo para la transformación genética con la cepa de A. tumefaciens C58C1RifR (pMP90) con el vector de transformación pTJK136. La presencia de los transgenes fue detectada mediante PCR y la hibridación por Southern en las líneas regeneradas. El número de insertos del nptII osciló entre una y dos. En el futuro, se requerirá de estudios relacionados con los mecanismos de síntesis de cardenólidos e identificación de enzimas específicas que permitan un incremento en la eficiencia de las alternativas estudiadas. Digitalis purpurea L. is one of only two species of economic interest of the Digitalis genus. Its importance lies in the fact that it constitutes one of the main sources of cardenolides, irreplaceable drugs in the treatment of heart failure. The present work was carried out with the objective of studying different biotechnological strategies in Digitalis purpurea L. that will allow to have the methodological basis for the development of a technology for the in vitro production of cardenolides. For its fulfillment a method of biomass production in temporary immersion systems (SIT) was developed, the effect of elicitors on the cardenolide content was determined and a protocol for the genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens was developed. The highest production of biomass by SIT (104.03 gMF and 5.74 gMS) was obtained when 12 explants were inoculated. The immersion frequency influenced the production of biomass and cardenolides in the shoots. In the treatment with dives every 4 hours the highest production of biomass and net production of cardenolides was obtained by SIT (digitoxin 167.6 μg and digoxin 119.9 μg). The additional renewal of the internal atmosphere in the SIT, as another factor evaluated, induced a greater oxidative stress associated with an increase in the synthesis of digitoxin. These results allowed scaling in SIT of 5L capacity and design a production scheme as a strategy to obtain cardenolides in vitro. On the other hand, it was demonstrated that elicitation is a possible strategy for the increase of cardenolides in D. purpurea outbreaks. The SilioPlant® (0.01 g.L-1) increased the synthesis of cardenolides in the shoots multiplied in vitro in 3.6 and 6.9 times the content of digoxin and digitoxin respectively, in comparison with the control. A protocol for genetic transformation was developed with the strain of A. tumefaciens C58C1RifR (pMP90) with the transformation vector pTJK136. The presence of transgenes was detected by PCR and Southern hybridization in the regenerated lines. The number of inserts of nptII ranged between one and two. In the future, studies will be required related to the mechanisms of cardenolide synthesis and identification of specific enzymes that allow an increase in the efficiency of the alternatives studied.(traducción automática)