La combinación de cromatografía líquida multidimensional y MALDI-TOF-MS para el análisis de huellas digitales de los péptidos secretados por las especies de anémona de mar inexploradas Phymanthus crucíferas

Abstract

Las anémonas de mar son fuentes de proteínas biológicamente activas y péptidos. Sin embargo, se conocen hasta la fecha pocos estudios peptidomic de estos organismos; Por lo tanto, la mayoría de las especies y su diversidad de péptidos permanecen sin explorar. En contraste al veneno anterior peptidomic trabaja en anémonas de mar y otros animales venenosos, en el presente estudio se combinaron cromatografía de intercambio iónico con gradiente de pH de filtración en gel y cromatografía de fase inversa, lo que permite la separación de los polipéptidos de 1-10 kDa a partir de la secreción de la mar inexplorado anémona Phymanthus crucíferas (Cnidaria / Phymanthidae). Este enfoque cromatográfico multidimensional seguido por la detección MALDI-TOF-MS genera una huella peptídica que comprende 504 valores de masa molecular diferentes a partir de péptidos ácidos y básicos, siendo el número más grande estimado para un exudado anémona de mar. La población de péptidos dentro del rango de 2,0 a 3,5 kDa de masa mostró la frecuencia más alta, mientras que los principales biomarcadores comprenden péptidos ácidos y básicos con masas moleculares dentro de 02/05 a 06/09 kDa, en contraste con el grupo homogéneo de 4-5 biomarcadores kDa que se encuentra en anémonas de mar tales como B. granulifera y B. cangicum (Cnidaria / Actiniidae). Nuestro estudio muestra que el péptido anémona de mar de huellas dactilares se puede mejorar en gran medida mediante la inclusión de cromatografía de intercambio iónico gradiente de pH en el enfoque de la separación multidimensional, complementada por la detección MALDI-TOF-MS. Esta estrategia nos permitió encontrar la diversidad más abundante y sin precedentes de componentes secretados a partir de un exudado de la anémona de mar, lo que indica que la búsqueda de nuevos péptidos biológicamente activos de estos organismos tiene un potencial mucho mayor de lo previsto anteriormente. Sea anemones are sources of biologically active proteins and peptides. However, up to date few peptidomic studies of these organisms are known; therefore most species and their peptide diversity remain unexplored. Contrasting to previous venom peptidomic works on sea anemones and other venomous animals, in the present study we combined pH gradient ion-exchange chromatography with gel filtration and reversed-phase chromatography, allowing the separation of the 1–10 kDa polypeptides from the secretion of the unexplored sea anemone Phymanthus crucifer (Cnidaria/Phymanthidae). This multidimensional chromatographic approach followed by MALDI–TOF-MS detection generated a peptide fingerprint comprising 504 different molecular mass values from acidic and basic peptides, being the largest number estimated for a sea anemone exudate. The peptide population within the 2.0–3.5 kDa mass range showed the highest frequency whereas the main biomarkers comprised acidic and basic peptides with molecular masses within 2.5–6.9 kDa, in contrast to the homogeneous group of 4–5 kDa biomarkers found in sea anemones such as B. granulifera and B. cangicum (Cnidaria/Actiniidae). Our study shows that sea anemone peptide fingerprinting can be greatly improved by including pH gradient ion-exchange chromatography into the multidimensional separation approach, complemented by MALDI–TOF-MS detection. This strategy allowed us to find the most abundant and unprecedented diversity of secreted components from a sea anemone exudate, indicating that the search for novel biologically active peptides from these organisms has much greater potential than previously predicted.